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怎样用间接法进行免疫荧光细胞化学染色

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以下是具体的实验操作步骤:
? ?(1)切片固定后用毛细滴管吸取经适当稀释的免疫血清滴加在其上,置于染色盒中保持一定的湿度,37℃作用30min。然后用0.01mol/l pH7.2PBS洗两次,10min,用吸水吸去或吹干余留的液体。
? ?(2)再滴加间接荧光抗体(如兔抗人γ-球蛋白荧光抗体等),同上步骤,染色30min,37℃,缓冲盐水洗两次10min,搅拌,缓冲甘油封固,镜检。
对照染色:
? ?①抗体对照:用正常兔血清或人血清代替免疫血清,再用上法进行染色,结果应为阴性。
? ?②抗原对照:即类属抗原染色,亦应为阴性。
? ?③阳性对照。
? ? ? ?间接法中上述方法称双层法(Double Layer Method)。另一种称夹心法,即用未标记的特异性抗原加在切片上先与组织中之相应抗体结合,再用该抗原之荧光抗体重叠结合其上,而间接地显示出组织和细胞中抗体的存在,方法步骤如下:
? ?①切片或涂片固定后,置于染色湿盒内。
? ?②滴加未标记的特异性抗原作用切片于37℃,30min。
? ?③缓冲盐水洗2次,每次5min,吹干。
? ?④滴加特异性荧光抗体再用切片于37℃,30min。
? ?⑤如③水洗。
? ?⑥缓冲甘油封固,镜检。
? ? ? ?间接法只需制备一种荧光抗体可以检出多种抗原,敏感性较高,操作方法较易掌握,而且能解决一些不易制备动物免疫血清的病原体(如麻疹)等的研究和检查,所以已被广泛应用于自身抗体和感染病人血清的试验。

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